The First Observation of theClinical Significance of LGT Proteome for Cancer Patients
PEI Yi, GUO SuTang,WANG QingXin, et al.
Shan Xi Tumor Hospital, Taiyuan,030013,P.R.China
[ABSTRACT] Objective:To analysis of the clinical significance of LGT(lost goodwill target) proteome. Methods: Serum samples were collected from 146 cancer patients who were treated in our studying group from April to December, 2004. Serum samples were added to a weak cation exchange 2 (WCX2) protein chip and analysed on the Protein Biology System surface enhanced laser desorption ionisation time of flight mass spectrometer (SELDI-TOF-MS) manufactured by Ciphergen Biosystems Inc.(Fremont, CA, USA). We repeatedly detected more than 2 times to aggravating patients. We establish the positive diagnosis criterion as following characteristic : having a mass cluster in the range of M/Z values 11,100+H～119,000+H.Being combined with the test times, the cases were divided into 6 groups to investigate the individual mortality. Results: Mortality of the six following groups: (1) LGT continuous positive, 100% (18/18). (2) LGT continuous negative, 0% (0/16). (3) LGT(+)→(-) after therapy 0%(0/12). (4) LGT suspected positive, 9.5% (2/21). (5) LGT positive (only one check), 17% (2/12). (6) LGT negative (one check only) 1.5% (1/65). Conclusions: If LGT proteome continuous positive, it implies that the disease advance d and predicts a worst case. If LGT proteome continuous negative, the prognosis is contrary, it means the disease lies stable. Taken it as a diagnosis platform to predict tumor progressing and conducted corresponding treatment, it helps to prolong the survival time of patients.
LGT蛋白质组对肿瘤患者临床意义首次观察报告
裴 毅1 郭素堂2 王清馨1 米振国2 赵嘉训2 刘维兰2 王 蓉3 韩 琳3 马小军3 古晓东3 姚 壁1 纪丕军1 杨永明1 魏淑青1
030013 太原，1山西省肿瘤医院特诊科
030013 太原，2山西省肿瘤医院研究所
030001 太原，3山西医科大学
0 引言
人类肿瘤蛋白质组的研究是目前恶性肿瘤研究的重要方法之一，利用蛋白质飞行质谱技术(SELDI-TOF-MS)检测某种肿瘤蛋白质组的质谱变化(指纹图谱)，用于肿瘤的早期发现，已有不少报道[1]。我们课题组在十一个月的时间内应用SELDI技术系统观察146例肿瘤患者在不同肿瘤情况下、不同病情发展阶段的动态血清蛋白质组的质谱，捕捉到了一组促进肿瘤患者病情恶化的异常蛋白质组，它在质谱图上标志醒目，指纹特征明显，呈孤立的质谱峰簇(cluster)表现，与其上、下游其他蛋白质组质谱峰簇的界线清楚。它具有可调控性，与肿瘤患者死亡关系密切，是一个良好的肿瘤死亡发生与否的预警蛋白质组的指纹标志。我们将其命名为LGT(lost goodwill target)蛋白质组。现将LGT蛋白质组对肿瘤患者临床意义的观察报告如下。
1、资料与方法：
1.1 临床资料
选择2004年4月—2004年12月31收治的恶性肿瘤患者146例，对患者在不同的病情、病期状态下(手术前、手术后、化疗前、化疗后、放射治疗前、放射治疗后、重病期间、衰竭状态)均行SELDI检测。非小细胞肺癌39例、小细胞肺癌5例、食管、贲门癌22例、胃癌15例、结肠癌30例、肝癌5例、胆囊癌2例、胰腺癌3例、肾癌3例、乳腺癌17例、淋巴瘤5例。男女之比1.98：1。常规进行不同治疗阶段、不同病期的血液学、血生化及影像学检查，记录病情变化和当时的体征检查情况。肿瘤特异性检查采用ELTSA法检测肿瘤标记物；双抗体夹心法及流式细胞技术检查免疫功能及淋巴因子系列；淋巴细胞AgNOR检测。
1.2 SELDI检查方法
1.2.1 基本实验条件
美国Ciphergen(赛弗吉)公司生产的蛋白质指纹仪以及该公司提供的WCX2芯片和PBS-Ⅱc芯片阅读机、阅读软件(Protein Chip software)主要试剂为Sigma公司生产的产品。其他检查取自山西省肿瘤医院、山西省肿瘤研究所的血液学、血生化及影像学检查。
1.2.2 SELDI检验方法
1.2.2.1 血清样本处理
取患者晨空腹血系列血清，-80℃保存。血清标本冰浴解冻，10,000r/min离心2min。取血清样品5ul，加10ul 9M尿素。振荡30min，加180ul缓冲液稀释(100mmol/L NaOAc pH4.0)，4℃ 10,000r/min离心2min，取上清待用。
1.2.2.2 芯片处理
将芯片放入盛有100mmol/L盐酸的试管中，振荡4—5min，HPLC水冲洗，将芯片安装到Bioprocessor上，每孔加200ul结合缓冲液，室温振荡5min，弃掉液体，重复一次。每孔上样100ul已处理好的血清样品，室温振荡1h。弃掉液体，用200ul结合缓冲液(100mmol/L NaOAc pH4.0)洗2次，每次5min，拆下芯片，待芯片自然干燥，然后每点加SPA *0.5ul，两次。干燥，用WCX2蛋白芯片阅读仪读芯片。* [SPA=Sinapinic acid为CAN(乙腈)50%和TFA(三氟乙酸)0.5%的饱和溶液]
1.2.2.3 数据收集
设定检样激光强度195，检测灵敏度8，收集数据质荷比(M/Z)范围1.0—2.0KD。收集位置20～80。平均每点收集20次，收集总点数是140次。在每次实验数据收集前，用All-in-one蛋白芯片校正仪器，使之误差<0.1%。以质量控制蛋白质芯片做重复性检测，其峰值的大小及其强度的变异系数(CVS)均控制在0.05%和15%以下，具有良好的重复性。
1.3 观察指标
LGT蛋白质组在不同情况下，与死亡出现的比率，用百分数进行统计。
2 结果分析
2.1 LGT蛋白质指纹图谱
2.2 LGT蛋白质组与死亡的相关性见表1。
*二例患者分别于2005年3月底和2005年4月中死亡，所以至2005年4月26日，LGT持续(+)患者全部死亡；
**其中五例是疑似(+)；
***其中有一例术前查LGT(+)，术后未查，失访，按死亡计。
3、讨论
SELDI技术的全称是表面增强激光解析离子飞行时间质谱技术(SELDI—TOF-MS；surface—enhanced laser desorption/ionization----time of flight----mass spectrometer)。其最大的特点是捕捉未知蛋白质或进行其他化学分析，用质谱图(指纹图谱)的形式描绘检测结果直观也很容易分析。本组研究在用WCX2芯片，对146名多种肿瘤患者，清晨空腹血清的对比分析中，发现了LGT(自命名：lost goodwill target)蛋白质组指纹图谱。其特征是在质荷比(M/Z)为11,100+H至11,900+H之间出现一组三峰或以上的质谱峰簇(cluster),其中一个质谱峰的丰度≥20%，但全部均≥5%，其与上游和下游峰簇的M/Z均大于1,000个质量单位；背景醒目，指纹特征突出，其疑似特征是仅在M/Z：11,100+H至11,900+H之间出现单峰且丰度值≥5%的指纹图谱(见图1)，以此做出诊断标准进行深化研究。
从表1的结果可以看出，LGT蛋白质组的出现与死亡有明显的相关性，研究的结果显示LGT持续(+)的患者其死亡率高达89.9%。实际上,在本稿件完成后,另2例也相继去世。说明LGT持续(+)的患者，其死亡率是极高的。研究中也看到仅做一次SELDI检查的阳性患者死亡率达17%，而其阴性的患者死亡率仅1.5%，二者之间是有显著差异的。将该结果同LGT持续(-)结果和LGT(+)→(-)结果比，就可以看出LGT(-)的患者其死亡率是极低的，而一次检查LGT(+)是不能预测死亡的发生。因为随着治疗的进程，有相当一部分的患者LGT从体内消失，生命得以延长，这说明该蛋白质组具有可调控性。因此，本文的研究结论认为，LGT持续(+)有很明确的临床意义，因为其可以预测肿瘤患者在随后的一段时间内死亡，而LGT检查(-)也有很明确的临床意义，因为有长期生存的可能性。所以LGT蛋白质组是一个很好的预测机体是否发生死亡的预警蛋白质组，它的可调控性将可成为逆转肿瘤患者死亡的早期诊断依据，它的阴性化是机体存活的早期诊断标志。
参考文献：
1. 肖雪媛，卫秀平，何大澄. 应用蛋白质芯片技术从血清中筛选肺癌标志蛋白[J]. 中国科学，2003，33(4)：323-328
