A Newly discovered fingerprint of functional proteome
PEI Yi, GUO SuTang, WANG QingXin, et al.
Shan Xi Tumor Hospital, Taiyuan, 030013, P.R.China

　　[ABSTRACT]Objective: To identify a newly discovered proteomic fingerprint and its diagnostic application. Methods: Serum samples were collected from 146 cancer patients who were treated in our study group from April to December, 2004. Serum were added to a weak cation exchange 2(WCX2) protein chip, and then analysed on the Protein Biology System surface enhanced laser desorption ionization time of flight mass spectrometer (SELDI-TOF-MS) manufactured by Ciphergen Biosystems Inc.(Fremont, CA, USA). The proteome fingerprint is shown by M/Z values. Results: By summarising 272 spectra, we discovered a specific mass cluster in the range of M/Z values 11,100+H ～11,900+H, with cluster peaks of amplitudes ≥5% and one or more than one  consecutive peak(s) ≥ 20% in it. No peak within M/Z values 1,000 +H of the upper and lower limits. In particular condition, no cluster appears but a small single peak with amplitude ≥5%—LGT(lost goodwill target).Conclusions: On the proteomic fingerprint pattern obtained by using the WCX2 chip SELDI technology, we established the diagnosis criterion as following characteristics according to the existence or amplitude of the proteome cluster in the range of M/Z values 11,100+H～11,900+H:(1)LGT(+): having a mass cluster, the maximum amplitude ≥20%, the minimum ≥5% and no peak within M/Z values 1,000+H of the upper and lower limits. (2)LGT(+/-): having a single peak ≥ 5% and no cluster.(3)LGT (-): having no cluster and peak.

一组新发现的肿瘤功能性蛋白质组的指纹图谱
裴 毅1  郭素堂2  王清馨1  米振国2  赵嘉训2  刘维兰2  王 蓉3  韩 琳3  马小军3  古晓东3  姚 壁1  纪丕军1  杨永明1  魏淑青1
030013 太原，1山西省肿瘤医院特诊科
030013 太原，2山西省肿瘤医院研究所
030001 太原，3山西医科大学

0引言
　　人类肿瘤蛋白质组的研究是目前恶性肿瘤研究的重要方法之一，新近的一些研究[1]利用蛋白质飞行质谱技术(SELDI-TOF-MS)检测某种肿瘤蛋白质组的质谱变化(指纹图谱)，用于肿瘤的早期发现，已有不少报道。我们课题组在十一个月的时间内应用SELDI技术系统观察了本组所收治的146例肿瘤患者在不同肿瘤情况下，不同病情发展阶段的动态血清蛋白质组的质谱，捕捉到了一组促进肿瘤患者病情恶化的异常蛋白质组，它在质谱图上标志醒目，指纹特征明显，呈孤立的质谱峰簇(cluster)表现，与其上、下游其他蛋白质组质谱峰簇的界线清楚。它具有可调控性，与肿瘤患者死亡关系密切，是一个良好的肿瘤死亡发生与否的预警蛋白质组的指纹标志。我们将其命名为LGT(lost goodwill target)蛋白质组，现将研究结果陆续报道。本文介绍的是LGT蛋白质组的指纹特征。

1、资料与方法：
1.1 临床资料
　　选择2004年4月—2004年12月31收治的恶性肿瘤患者146例，对患者在不同的病情、病期状态下(手术前、手术后、化疗前、化疗后、放射治疗前、放射治疗后、重病期间、衰竭状态)均行SELDI检测。非小细胞肺癌39例、小细胞肺癌5例、食管、贲门癌22例、胃癌15例、结肠癌30例、肝癌5例、胆囊癌2例、胰腺癌3例、肾癌3例、乳腺癌17例、淋巴瘤5例。男女之比为1.98：1。常规进行不同治疗阶段、不同病期的血液学、血生化及影像学检查，记录病情变化和当时的体征检查情况。肿瘤特异性检查采用ELTSA法检测肿瘤标记物；双抗体夹心法及流式细胞技术检查免疫功能及淋巴因子系列；淋巴细胞AgNOR检测。

1.2  SELDI检查方法
　　1.2.1 基本实验条件
　　美国Ciphergen(赛弗吉)公司生产的蛋白质指纹仪以及该公司提供的WCX2芯片和PBS-Ⅱc芯片阅读机、阅读软件(Protein Chip software)主要试剂为Sigma公司生产的产品。其他检查取自山西省肿瘤医院、山西省肿瘤研究所的血液学、血生化及影像学检查。

　　1.2.2 SELDI检验方法
　　1.2.2.1 血清样本处理
　　取患者晨空腹血系列血清，-80℃保存。血清标本冰浴解冻，10,000r/min离心2min。取血清样品5ul，加10ul 9M尿素。振荡30min，加180ul缓冲液稀释(100mmol/L  NaOAc  pH4.0)，4℃ 10,000r/min离心2min，取上清待用。

　　1.2.2.2 芯片处理
　　将芯片放入盛有100mmol/L盐酸的试管中，振荡4—5min，HPLC水冲洗，将芯片安装到Bioprocessor上，每孔加200ul结合缓冲液，室温振荡5min，弃掉液体，重复一次。每孔上样100ul已处理好的血清样品，室温振荡1h。弃掉液体，用200ul结合缓冲液(100mmol/L  NaOAc  pH4.0)洗2次，每次5min，拆下芯片，待芯片自然干燥，然后每点加SPA 0.5ul，两次。干燥，用WCX2蛋白芯片阅读仪读芯片。[SPA=Sinapinic acid为CAN(乙腈)50%和TFA(三氟乙酸)0.5%的饱和溶液]

　　1.2.2.3 数据收集
　　设定检样激光强度195，检测灵敏度8，收集数据质荷比(M/Z)范围1.0—2.0KD。收集位置20～80。平均每点收集20次，收集总点数是140次。在每次实验数据收集前，用All-in-one蛋白芯片校正仪器，使之误差<0.1%。以质量控制蛋白质芯片做重复性检测，其峰值的大小及其强度的变异系数(CVS)均控制在0.05%和15%以下，具有良好的重复性。

2、结果分析
2.1  LGT蛋白质指纹图谱的描述，见图1、图2




　　本图可以看到这是一个在100%相对丰度(relative abundance)焦平面表示的蛋白质指纹图，其中C2是LGT蛋白质组指纹图，是一组质/核比(M/Z)由11100+H至11900+H组成的质谱峰簇(cluster)样指纹图谱，与上游峰簇以及下游峰簇比，其M/Z约相差1000个质量单位以上，LGT蛋白质组质谱峰簇中至少有一个质谱峰相对丰度≥20%，将其放大，并拉伸观察，该峰簇由三峰以上组成(见图2)。[注：由于基线漂移(drift)和视觉误差会造成约50个质量单位的漂移，因此本数值近似值，相当于100个质量单位的漂移(以下同)。]





3、讨论

　　SELDI(Surface-enhanced laser desorption/ionization)技术的全称是[SELDI-TOF-MS]，即表面增强激光解析离子飞行时间(time of flight)质谱技术，其结果是用MS(质谱计mass spectrometer)在一焦平面上，按被检物质的质荷比(M/Z)大小，顺次记录其含量的大小(丰度)进行描述。是赛弗吉(Ciphergen)公司新近推出的一种集合系列型蛋白质芯片(Proteinchip)和激光解析电离质谱技术相结合的检测体液技术的蛋白质分析平台——蛋白指纹仪。其最大特征是用一组称为Proteinchip的蛋白质芯片，在检测前根据不同的蛋白质与芯片内容结合方式的不同就将被检的蛋白质大致分类，进行初筛。因此这种方法简单、易行、准确、分析简化，最主要特征是可以进行定量蛋白质的研究。从方法学上明显优于目前流行的MELDI(Matrix-assisted laser desorption/ionization)技术。SELDI技术常用的芯片有五种，即SAX2(强阴离子交换芯片)WCX2和CM10(弱阳离子交换芯片)H4(疏水表面芯片)IMAC3(固定金属亲合捕捉蛋白芯片)等。本研究采用的芯片是WCX2蛋白芯片，其由弱羧基阴离子构成活性芯片表面，用于捕捉表面带有正电荷的蛋白质分子，因此富含带正电荷碱性氨基酸，如赖氨酸、精氨酸和组氨酸等低等电点蛋白质优先被捕获。因为此类蛋白质人体含量比例较高，翻译后的修饰作用明显，因此用其捕捉未知蛋白机率较大。

　　本研究从五个不同的角度描述LGT蛋白质组的指纹图谱特征，研究结果表明，在采用WEX2芯片，用SELDI—TOF—MS技术检测空腹血清，并在一焦平面上按被检蛋白质质荷比(M/Z)大小顺次记录其含量大小(丰度---纵坐标)，得出的记录结果---蛋白质指纹图谱上，在11,100+H至11, 900+H之间出现三峰或以上的质谱峰簇(cluster)是LGT蛋白质组指纹图谱的特征，其中一个或多个质谱峰丰度≥20%，其余均在5%以上；LGT蛋白质组的质谱峰簇距上游质谱峰簇和下游质谱峰簇的质荷比(M/Z)均大于1000个质量单位，它的疑似特征是仅在11,000+H至11,900+H之间出现单峰且丰度值≥5%的指纹图谱。

　　有关该蛋白质的临床意义以及其他观察结论，将在随后的文章中陆续报道。


参考文献：
1. 肖雪媛，卫秀平，何大澄. 应用蛋白质芯片技术从血清中筛选肺癌标志蛋白[J]. 中国科学，2003，33(4)：323-328